Viability assay (WST) - KS

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나노물질의 생물 안전성 평가-WST-8 assay를 이용한 나노물질의 세포 생존율 평가 KS A 00001:2014

개 요

나노기술 분야는 새로운 재료, 제품 및 응용분야의 개발을 통해 빠른 속도로 계속 발전하고 있다. 하지만 이와 동시에 이러한 물질이 인간의 건강과 환경에 미치는 잠재적인 영향에 관하여 많은 질문들이 제기되고 있다. 이를 좀 더 이해하고 잠재적인 위험을 정량화하기 위해 국제적으로 많은 연구들이 진행되고 있다. 나노입자는 표면적이 크기 때문에 나노입자의 독성은 생산 또는 처리과정에서 표면 코팅 화학물질들에 의해 변경될 수 있다. 따라서 다른 화학적 작용을 가진 나노입자에 대한 신뢰성 있는 독성 고속 검출 방법이 필요하다. 현재 나노입자의 독성 평가에 관한 연구가 진행되고 있지만, 그 결과가 항상 일치하지는 않는다. 그러므로 나노입자 독성 평가를 위해 신뢰성 있는 방법을 활용하는 것이 중요하다. 본 기술은 고속 대량 스크리닝으로 세포 생존율을 확인하는 방법이다. 따라서 나노입자 본연의 독성과 다른 표면 화학 작용을 가진 나노입자의 잠재적인 독성의 빠른 평가를 제공한다.

세포의 생존율을 확인하기 위해 tetrazolium salt를 사용하는 방법이 널리 이용되고 있고, MTT, MTS, XTT, WST-1과 같은 다수의 기술들이 있다. Tetrazolium salt는 살아있는 세포에 존재하는 탈수소효소에 의해 쉽게 환원되어 formazan을 형성한다. 기존 tetrazolium salt (MTT)는 물에 녹지 않는 formazan을 형성하며 이를 녹이는데 유독성 유기용매 (DMSO)가 필요했다. 또한 반응 용기까지 염색시켜 위양성 (false positive)를 유발한다. 이러한 문제점을 개선하기 위해 수용성인 WST (water soluble tetrazolium)이 개발되었다. WST는 살아있는 세포와 반응하여 오렌지색 수용성의 formazan을 생성한다. 따라서 녹이는 과정이 불필요하고 배양액을 제거할 필요가 없어 suspension cell에 대해서도 간편하게 실험을 수행할 수 있다. 또한 이 방법에 사용되는 WST는 세포 독성이 매우 적어 같은 플레이트에서 세포 생존율 실험과 함께 다른 여러 가지 실험들을 수행할 수 있다. 최근에 electro mediator인 1-methoxy PMS와 친화력이 개선되고 용해도가 더욱 향상된 WST-8이 개발되었다. WST-8은 세포 증식 및 독성 평가 실험에서 세포 생존율을 측정하는 감도 높은 비색분석법으로써, MTT, XTT, MTS, WST-1과 같은 다른 tetrazolium salts 보다 더 높은 검출 감도를 가진다.

나노입자의 세포 독성 평가 시 잘못된 분석을 방지하고 나노입자의 assay 광흡수 여부를 확인하기 위하여 나노입자의 간섭영향을 확인하는 것이 중요하다.


목 차


머 리 말

개 요

1 적용범위

2 용어와 정의

3 실험 재료

4 나노입자 시료 준비

4.1 분산 준비

4.2 배양 배지에서 안정성 평가를 위한 분산액 준비

4.3 분산액 특성 분석

4.4 실험을 위한 시료 준비

5 세포 생존율 실험 준비

5.1 배양 배지

5.2 세포 동결 방법

5.3 세포 해동 방법

5.4 세포 배양

5.5 세포 생장 확인

5.6 나노물질 간섭영향 평가

5.7 대조물질 준비

6 나노물질의 세포 생존율 검사

6.1 세포 plate 준비

6.2 나노입자 농도 plate 준비

6.3 세포에 나노입자 노출

6.4 CCK-8 시약 처리

6.5 Formazan 흡광도 측정

7 세포 생존율 계산

8 시험 보고서

9 결과의 평가

그림 목차 그림 1― A549 세포 사진 15 그림 2 ― 나노입자의 독성평가를 위한 실험 도식 16 그림 3 ― 세포 생존율 실험을 위한 세포 PLATE 레이아웃 17 그림 4 ― 세포 생존율 실험을 위한 나노입자 및 양성대조물질의 농도 PLATE 레이아웃 18


표 목차 표 1 ― 양성대조물질과 나노입자 준비 18



한국산업표준 KS A 00001:2014


㉿ 나노물질의 생물 안전성 평가- WST-8 assay를 이용한 나노물질의 세포 생존율 평가


Effect of Nanoparticles on Cell viability (WST-8 assay)

1 적용범위

이 표준은 WST-8 assay를 이용하여 나노물질의 세포 독성 평가 방법을 규정하고 있다. 이 시험법은 세포배양액에 나노물질을 노출시킨 후 세포 생존율 확인에 대하여 기술하고 있다. 수용성 tetrazolium salt인 WST-8은 살아있는 세포와 반응하여 오렌지색 수용성의 formazan을 생성하고, 이는 살아있는 세포수에 직접 비례한다. 이 시험방법은 나노물질의 특성을 고려하여 체외에서 포유 동물 세포의 생물 반응을 파악할 수 있도록 되어 있다.

2 용어와 정의 이 표준의 목적을 위하여 ISO/TC 229/SC N 1070 및 KS A ISO TS27687에 준하여 다음과 같이 용어의 정의를 적용한다.

2.1 응집 (agglomeration) 입자나, 집합체(aggregates) 또는 이 둘의 혼합체(mixtures)가 서로 약하게 결합된 집합체로 표면적이 개별 구성체 표면적의 합과 비슷한 것.

2.2 배양 용기 (culture vessels) 유리 배양 접시, 플라스틱 배양 플라스크 또는 플라스틱 다중 배양판 및 미세 정량판 등을 포함하는 세포 배양에 적절한 용기 비고 배양 용기는 조직 배양을 위한 조건을 만족하고 포유 동물 세포의 사용에 적절해야 한다.

2.3 양성 대조 물질 (positive control material) 이 표준에 따라 시험하였을 때 세포 독성을 나타내는 물질 비고 양성 대조 물질을 사용하는 것은 시험 시스템의 적절한 반응을 알아보기 위함이다.

2.4 분산액 (dispersion) 응집되지 않은 나노입자를 포함하는 안정된 농축 용액

2.5 검사 시료 (test sample) 생물학적 또는 화학적 시험 또는 평가에 사용되는 나노입자 분산액

2.6 나노크기 (nanoscale) 약 1 nm에서 100 nm 범의의 크기

2.7 나노물체 (nano-object) 3차원의 외형치수 중 하나, 둘, 또는 셋이 나노크기인 물질 비고 외형치수는 x, y, z 세 축의 3차원 공간에서 나노물체의 입체적 크기를 표현하기 위해서 사용함.

2.8 나노입자 (nanoparticle) 3차원의 외형치수 모두가 나노크기인 물체 비고 만일 나노물체의 가장 긴 축과 가장 짧은 축 간의 길이가 일반적으로 3배 이상 차이가 나면 나노입자란 용어보다는 나노막대 또는 나노판이라는 용어를 사용해야 한다.

3 실험 재료

3.1 세포주 (cell lines) A549 (adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells) 비고 잘 확립되어 있는 세포주가 바람직하며, 사용할 때에는 공인된 저장소로부터 제공받아야 한다.

3.2 분석 시험법 (assay) WST-8 [2-(2-methoxy-4nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt] (Cell Counting Kit-8(CCK-8), Dojindo, CK-04)

3.3 배지 (chemicals media and sera)

3.3.1 RPMI1640 medium

3.3.2 FBS (Fetal bovine serum)

3.3.3 1X Penicillin/Streptomycin

3.3.4 0.25% Trypsin-EDTA

3.3.5 Phosphate buffered Saline [Ca and Mg free]

3.3.6 0.4% Trypan blue solution

3.3.7 Distilled water

3.4 장비 및 소모품

3.4.1 무균작업대

3.4.2 세포배양기 (37℃, humidified, 5% CO2/air)

3.4.3 현미경

3.4.4 원심분리기

3.4.5 정밀저울

3.4.6 흡인기 (Aspiration pump)

3.4.7 교반기 (Vortex mixer)

3.4.8 pH 측정기

3.4.9 항온 수조

3.4.10 Multiple well plate reader

3.4.11 Flat bottom 96-well tissue culture plate

3.4.12 파이펫 (single/multi-channel pipette)

3.4.13 Hemocytometer

3.4.14 Conical tube

3.4.15 Reservoir

3.4.16 세포 배양용기

4 나노입자 시료 준비

4.1 분산 준비

시료는 시험 전기간 동안 안정적인 생체 적합한(biocompatible) 용액에 반드시 분산되어야 한다. 즉, 시험기간동안 응집없는 안정한 상태로 분산시켜야 한다. 나노입자의 분산 방법은1) 나노입자의 본질적인 세포 독성을 평가할지, 2) 표면 기능화된 나노입자의 세포 독성을 평가할지 여부에 따라 결정된다. 나노입자 고유의 세포독성 평가를 위해, 생체 적합한 이온으로 표면을 코팅하거나 알부민과 같은 생물학적으로 분해 가능한 물질로 코팅하여 분산하여야 한다. 이온으로 표면을 코팅할 경우, 역삼투 또는 중화염의 첨가 등으로 초기 분산액의 pH를 반드시 조정해야 한다. 이 과정을 통해 분산액은 나노입자의 응집이 허용되지 않고 안정하게 유지되어야 한다. 세포에서 나노입자의 평가를 위해, 나노입자 분산액에서 화학 물질은 제거해야 한다.

4.2 배양 배지에서 안정성 평가를 위한 분산액 준비

4.3 분산액 특성 분석

4.3.1 나노입자의 분산 상태는 ISO-22412에서 설명된 것처럼 DLS로 확인해야 한다.

4.3.2 분산액은 내독소가 없음을 확인해야 한다.

4.3.3 분산액에서 나노입자의 크기 분포와 안정성은 48시간까지 확인해야 한다.

비고) 실험은 24시간까지 진행하더라도, 분산액은 실험 시간이 지난 후까지 안정한지 확인해야 한다.

4.3.4 배양 배지에서 분산 안정성 분산액은 적절한 농도 범위 (1, 5, 10, 50, 100 ㎍/㎖)에서 배양 배지에서 안정성을 확인해야 한다. 만약 배양 배지에서 분산이 48시간까지 안정하지 않다면, 실험에 사용하기 위해 분산 안정성이 적합하도록 조정할 필요가 있다.

비고) 입자의 평균 크기는 배양 배지에서 생체 분자와 단백질의 흡착으로 인해 증가될 수 있다.

4.4 실험을 위한 시료 준비 모든 나노입자 용액은 원액 (예: 10 ㎎/㎖)에서 신선하게 준비해야 한다. 세포 배양 실험을 위해 원액은 사용 직전에 교반기로 완전히 섞은 후 사용한다.

비고) 나노입자 시료 준비를 위해 제안하는 방법은 멸균된 50 ㎖ tube를 사용하고, 원액 나노입자를 tube 벽 대신에 배양 배지로 직접 첨가한 후 교반기로 충분히 혼합한다. 이 절차는 박테리아나 곰팡이로부터 세포 배양 배지의 오염을 최소화 하기 위하여 무균작업대에서에서 수행한다.

5 세포 생존율 실험 준비 모든 용액 (배양 배지 제외)과 유리제품 등은 멸균해야 하며, 모든 절차는 무균작업대에서 수행되어야 한다

5.1 배양 배지

5.1.1 세포 동결용 RPMI1640 medium (10% FBS) 1X Penicillin/Streptomycin 10% DMSO


5.1.2 세포 배양용 RPMI1640 medium (10% FBS) 1X Penicillin/Streptomycin

5.2 세포 동결 방법

5.2.1 배양중인 세포의 배양용기에서 배양배지를 제거하고 PBS로 세척한다. 5.2.2 0.25% trypsin-EDTA를 1 ㎖ 넣고 세포배양기에서 3분간 반응시킨 뒤 세포를 수거한다. 5.2.3 1,000 rpm으로 3분간 원심분리하여 세포를 모은다. 5.2.4 세포 동결용 배지 1 ㎖로 분산시킨다. 5.2.5 세포 동결 용기에 세포 부유액을 빠르게 담는다. 5.2.6 -80℃에서 하루 보관한다. 5.2.7 다음날 액체 질소 탱크로 옮겨서 보관한다.

5.3 세포 해동 방법

5.3.1 배양 배지를 37℃ 항온 수조에 넣고 약 15~20분간 데운다. 5.3.2 15 ㎖ tube에 배양 배지를 9 ㎖ 채운다. 5.3.3 액체 질소 탱크에서 동결된 세포를 꺼내어 항온 수조에 넣고 흔들면서 녹인다. 이때 완전히 녹이지 않고 얼음 덩어리가 약간 남을 때 까지만 녹인다. 5.3.4 해동한 세포를 무균작업대로 가져온 뒤 배양 배지를 넣어둔 15 ㎖ tube에 천천히 넣는다. 5.3.5 1,000 rpm으로 3분간 원심분리하여 세포를 모은다. 5.3.6 상층액을 제거한 뒤 배양 배지를 넣어 세포를 분산시킨다. 5.3.7 배양용기에 세포를 넣은 뒤 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양한다.

5.4 세포 배양 5.4.1 배양중인 세포의 배양용기에서 배양 배지를 제거하고 PBS로 세척한다. 5.4.2 0.25% trypsin-EDTA를 1㎖ 넣고 세포배양기에서 3분간 반응시킨 뒤 세포를 수거한다. 5.4.3 1,000 rpm으로 3분간 원심분리하여 세포를 모은다. 5.4.4 상층액을 제거한 뒤 배양 배지를 넣어 세포를 분산시킨다. 5.4.5 세포를 1:4 또는 1:5의 비율로 세포용기에 넣고, 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양한다. 5.4.6 세포가 배양용기에서 80% 정도 차면 계대 배양을 실시한다. 보통 이틀에 한번씩 계대 배양을 한다. 비고 세포는 최대 20 계대까지 사용할 수 있다.

5.5 세포 생장 확인 실험을 수행하기 전에 각 실험실에서는 세포가 건강하게 자랐는지 확인해야 한다. 세포 생장은 주로 생존율과 배가시간을 확인한다. 세포 생존율은 95% 이상을 유지해야 한다.

5.5.1 배양중인 세포의 배양용기에서 배양 배지를 제거하고 PBS로 세척한다. 5.5.2 0.25% trypsin-EDTA를 1㎖ 넣고 세포배양기에서 3분간 반응시킨 뒤 세포를 수거한다. 5.5.3 1,000 rpm으로 3분간 원심분리하여 세포를 모은다. 5.5.4 상층액을 제거한 뒤 배양 배지를 넣어 세포를 분산시킨다. 5.5.5 0.4% trypan blue 용액을 세포 부유액과 1:1 비율로 혼합한 뒤, hemocytometer에 10 ㎕ 넣는다. 5.5.6 현미경으로 살아있는 세포와 죽은 세포를 계수하여 생존율을 확인한다 (살아있는 세포는 염색되지 않고, 죽은 세포는 파란색으로 염색된다).

5.6 나노물질 간섭영향 평가 5.6.1 나노물질 분산액을 물로 희석하여 1, 10, 25, 50, 100 ㎍/㎖로 준비하고, 96 well plate에 한 농도당 100 ㎕씩 세 열에 넣는다. 5.6.2 CCK-8 assay 시약을 각 칸에 10 ㎕ (나노물질 분산액의 1/10 양)씩 첨가한다. 5.6.3 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 1시간 반응시킨다. 5.6.4 Multiple well plate reader로 450 nm에서 흡광도를 측정한다. 5.6.5 나노물질이 CCK-8 assay 시약을 흡광영역에 간섭하지 않는지 확인한다. 비고 만약 나노물질이 CCK-8 assay에 간섭영향을 준다면 간섭영향을 주지 않는 다른 assay로 변경한다.

5.7 대조물질 준비 CdSO4는 세포에 심각한 독성이 있고, 양성 대조물질로 사용된다. 나노입자를 노출 시키지 않는 세포는 계대수에 따른 세포의 생존율을 결정하는데 사용된다. 그리고 나노입자가 assay시 잠재적인 간섭을 일으킬 수 있는지 여부를 확인하기 위해서 칸을 분리하여 실험한다.

5.7.1 CdSO4 원액 용액 준비 (10 mM) 5.7.1.1 멸균된 15 ㎖ tube에 황산 카드뮴 25.66 ㎎을 넣는다. 5.7.1.2 멸균수 10 ㎖을 첨가한 뒤 잘 섞는다. 5.7.1.3 준비된 10 mM CdSO4를 4℃에 보관한다.

6 나노물질의 세포 생존율 검사 나노입자 분산액은 준비할 때마다 그 특성이 변동될 가능성이 있으므로, 세 번의 반복실험은 각기 다른 날에 새로 분산하여 실험해야 한다.

6.1 세포 plate 준비 6.1.1 배양중인 세포의 배양용기에서 배양배지를 제거하고 PBS로 세척한다. 6.1.2 0.25% trypsin-EDTA를 1 ㎖ 넣고 세포배양기에서 3분간 반응시킨 뒤 세포를 수거한다. 6.1.3 1,000 rpm으로 3분간 원심분리하여 세포를 모은다. 6.1.4 배양 배지를 첨가하여 세포를 분산시키고, 0.4% trypan blue 용액을 세포 부유액과 1:1 비율로 혼합한 뒤 10 ㎕ 취하여 hemocytometer에 넣는다. 6.1.5 현미경상으로 관찰하면서 대각선 방향으로 1㎟의 네 칸 안에 있는 살아있는 세포를 센 다음 평균을 구한다. 비고 1 ㎟ 한 칸 안에는 50개에서 200개의 세포수가 적당하다. 만약 50개 미만이거나 200개 이상이라면 희석비율을 다시 조정하여 준비한다. 6.1.6 세포 수는 다음과 같이 계산한다. 세포 수 = 한 칸당 평균 세포 수 x 희석비율 x 104/㎖ 비고 죽은 세포가 25% 이상이면 실험에 사용하지 않고 다시 배양한다. 6.1.7 세포 부유액을 1 x 105 cells/㎖로 준비하고, 준비된 세포를 8-channel pipette를 이용하 96 well plate에 100 ㎕씩 넣으면 최종 1 x 104 cells/㎖로 세포가 준비된다. 6.1.8 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 24시간 배양한다.

6.2 나노입자 농도 plate 준비 6.2.1 96 well plate의 2, 3, 4, 5열은 표 1에서 나타낸 것처럼 CdSO4를 배양 배지로 희석하여 농도 별로 준비한다. 6.2.2 8, 9, 10, 11열은 표 1에서 나타낸 것처럼 나노입자를 배양 배지로 희석하여 농도 별로 준비한다.

6.3 세포에 나노입자 노출 6.3.1 6.1.7에서 준비된 세포 plate에서 석션기를 사용하여 배양 배지를 제거한다.\ 6.3.2 6.2에서 준비된 나노입자 농도 plate에서 CdSO4와 나노입자 분산액을 8-channel pipette를 이용하여 100 ㎕씩 첨가한다. 비고 나노입자 분산액은 세포에 처리하기 전에 충분히 잘 섞은 후 사용한다.

6.4 CCK-8 시약 처리 6.4.1 8-channel pipette를 이용하여 CCK-8 assay 시약을 각 칸에 10 ㎕ (배양 배지의 1/10 양)씩 첨가한다. 6.4.2 37℃, 5% CO2 incubator에서 1시간 반응시킨다.

6.5 Formazan 흡광도 측정 Multiple well plate reader를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정한다

7 세포 생존율 계산 7.1 흡광도 측정값으로 세포 생존율을 계산하고 결과는 백분율 (%)로 나타낸다. 7.2 Background 제거를 위해 96 well plate 7열의 흡광도 값을 평균 낸 뒤, 각 칸의 흡광도 값에서 뺀다. 7.3 CdSO4와 나노입자를 처리하지 않은 B행 2~5열과 8~11열의 흡광도 값을 각각 평균 낸 뒤, 물질을 처리한 C~G행의 흡광도 값을 normalization한다. 7.4 Normalization 후, 각 농도별 흡광도 값의 평균값과 표준편차 값을 계산한 후 그래프를 그린다. 7.5 50% 저해 농도 (IC 50) 값은 sigma plot 등의 생물학적 통계 소프트웨어를 사용하여 확인한다.


8 시험 보고서 시험 보고서에는 다음의 세부 사항이 모두 포함되어야 한다.

8.1 시료에 대한 설명 8.2 세포주와 선정근거 8.3 배지 8.4 분석 방법과 이론적 원리 8.5 시료 준비 과정 (필요 시)과 가능하다면 시료의 농도와 특성 8.6 음성, 양성 및 기타 대조군 8.7 세포 반응과 기타 관찰 사항 8.8 그 외 결과 평가에 필요한 관련 자료

9 결과의 평가 시험 결과의 전체적인 평가는 주어진 시험 자료에 기초하여 결정을 내릴 수 있는 자격과 지식을 갖춘 자가 해야 한다. 만일 시험 결과가 적절하지 않아 결정을 내릴 수 없거나 유의성을 상실한 경우에는 재시험해야 한다.