UV-Vis measurement

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Introduction

배경 (Background)

Lambert-Beer 법칙

용액의 흡광도는 그 광로의 길이와 농도의 양쪽에 비례한다고 하는 법칙이다. 두께 d의 용매층 및 용액층을 지난 빛의 세기를 각각 Io 및 I로 하고, 용액의 농도를 c, 비례 상수를 α로 하면 다음 식으로 나타내어집니다.

Lambert-Beer 법칙

이 법칙은 흡광도가 물질 속의 광로의 길이에 비례한다고 하는 람베르트의 법칙과 용액의 농도에 비례한다고 하는 베르의 법칙을 조합한 것입니다. 용액의 농도가 묽은 용질 분자끼리의 상호 작용이 없을 때는 이 법칙이 상당히 잘 성립하지만 농도가 커져 상호 작용이 있을 때는 성립하지 않습니다다. 법칙이 성립하는 범위에서는 광흡수하여 용질의 정량 분석을 쉽게 할 수 있습니다..

UV-Vis 구조

UV-Vis 구조

1) 광원 (Source)

UV-Vis sources2.png

UV-Vis은 자외선과 가시선 파장대의 흡광도를 측정할 수 있고 각각에 해당하는 두 가지 광원으로 구성되어 있습니다.

- UV (자외선) 영역: Deuterium 중수소램프

- Visible (가시광선) 영역: Tungsten 텅스텐 램프

2) 큐벳 (cuvett) 선택

큐벳을 선택할 때, 두 가지 고려사항이 있다.

  • 측정하고자 하는 샘플의 흡광도에 맞는 파장에서 사용가능한 큐벳은 플라스틱, 유리 그리고 석영큐벳이 가장 흔하게 사용됩니다.
Vis cuvvett.png

플라스틱은 300~900 nm, 유리는 260~2500 nm, 석영은 190~2500 nm의 영역의 빛을 투과시켜줍니다.

일반적으로 플라스틱 큐벳을 가장 많이 사용한다. 하지만 용매에 적합한 용기재질을 선택하고 세척을 적절히 함으로 측정오차를 줄일 수 있다.

  • 샘플의 용매
UV-Vis solvent.png

solvent cut-off 는 용매 자체적으로 광원을 흡수하는 특정 파장대로, 모든 샘플의 용매는 UV-Vis 영역에서의 cut-off 파장을 가지고 있습니다..

이러한 두가지 조건을 모두 고려해서 샘플에 맞는 큐벳을 선택해야 합니다.

예를 들면, 유기용매의 경우 플라스틱 큐벳을 사용하면 안된다. 유기용매를 플라스틱 큐벳에 넣을 시 큐벳이 녹을 수 있고, cut-off 파장 역시 <300 nm이기 때문입니다.

다른 예로, HF 같은 산이나 강염기의 경우 유리재질의 큐벳을 부식시키기 때문에 적절하지 않습니다.

절차 (Procedure)

나노입자의 PChem을 분석하는 데 있어 UV-Vis은 용액 내 나노입자의 분산안정성을 측정하기 위해 사용한다. 나노입자의 용액 내 분산안정성을 측정하는 법은 다음과 같다.

장비 모델 : OPTIZEN 3220UV (Mecasys)

UV-Vis equipment1.png

1) 시료준비

-시료를 만들기 위해서 우선, 대략적인 농도를 정하는 것이 좋은데, 흡광도가 0.3~1.0에 위치하도록 나올 수 있게 만들어 주는 것이 좋다. 일반적으로, 시료의 비율과 용매의 비율이 1:9 또는 2:8로 용액을 묽히면 적정 흡광도 범위안에 위치한다.

-측정 시료는 최소 1ml~3ml정도로 만들어야하며, 만약에 1ml 시료를 만들었을 경우에는 UV-vis의 빛이 측정하는 시료를 통과하는 높이를 지나갈 수 있도록 장비 안에 있는 큐벳 홀더 아래쪽에 큐벳 뚜껑을 넣어줌으로써 높이를 올려주면 측정을 할 수 있다.

-측정하고 싶은 (용매, 용질 입자)에 따른 시료를 만들어 준다. 추가적으로 Baseline을 잡아주기 위해서 Blank 시료도 만들어야 한다.

ex. 용질 입자:Fe3O4, Fe2O3

용매: water, RPMI

-위와 같은 식으로 있다면, 1ml의 시료를 만들고 싶다면, (Blank: water 1ml, RPMI 1ml) ,(Fe3O4 in water (1ml), Fe2O3 in water (1ml)),(Fe3O4 in RPMI (1ml), Fe2O3 in RPMI (1ml)) 이렇게 총 6개의 시료를 만들어주면 된다.

- 각각의 시료를 만들어 줄 때, 피펫팅을 이용해서 잘 섞어주도록 한다.

-시료를 모두 만들었다면, 큐벳 뚜껑에 시료의 이름을 알아볼 수 있게 써주고, 큐벳에 결합시킨 후 파라필름으로 밀봉해준다.

-시료 제조 순서: 큐벳, 마이크로 피펫, 피펫팁 준비→용매, 용질을 적정량 큐벳에 첨가→ 큐벳 뚜껑 결합 및 파라필름으로 밀봉

▷주의사항: 시료를 만들어주는데 있어서 거품이 생기게 되면 측정하는데 영향을 주기 때문에 주의해야 한다. 

2)시료 상태에 따른 샘플링

일반적으로 용액으로 존재하는 시료의 경우 0.3-1.0 영역의 흡광도 범위에 위치하게끔 농도를 묽혀 준다.

고체 파우더로 존재하는 시료의 경우 문헌조사나 존재하는 프로토콜에 따라 적정 용매에 묽혀 sonicator나 voltexing을 통해 잘 분산시켜 흡광도를 측정한다.

예를 들어, TiO2 파우더는 10g/L TiO2에 DI 용액을 용매로 10분동안 porbe sonicator를 이용하여 분산시켜 용액으로 제조하였다. (Song H.L et al. Bull.Korean Chem. Soc. 2014, Vol. 35, No.7)

3) 측정방법

1) 기기의 안정화를 위해 장비를 켜고 30분 동안 예열시켜준다. 기기를 켜면 기기가 자동으로 자체점검을 실시한다. 위에서 왼쪽 장비의 경우에는 장비의 전원을 off→on으로 해주게 되면 자동으로 컴퓨터와 연결되어 있어서 컴퓨터가 켜진다. 하지만 자동으로 연결되지 않는 위에서 오른쪽의 장비 같은 경우에는 장비가 켜진 후 자체점검이 모두 완료된 후에 6번을 눌러서 컴퓨터와 연결해줘야 한다. 장비를 켜주고 나서 (Optizen view) software를 실행시킨다. 기기의 전원 스위치는 보통 장비의 뒤쪽에 위치해있다.

UV-Vis equipment2.png

2) 위의 메뉴에서 New 를 클릭하여 측정모드(Survey Scan)를 선택한다.

Survey Scan : 원하는 파장영역을 선택하여 흡광도를 측정하는 모드

UV-Vis equipment3.png

3)준비한 시료와 blank (시료의 용매만 채운 용액)를 샘플 홀더에 넣는다.

Blank는 샘플 홀더 내부의 B 자리

UV-Vis equipment4.png

4) 5)에 있는 그림에서 A에 나와 있는 그림에서 홀더에 넣은 시료에 해당하는 것을 체크해준다.(체크한 홀더에 있는 시료만 측정)

5) 아래의 항목들을 입력한다.

UV-Vis equipment5.png

START WAVE : 측정 시작 파장

END WAVE : 측정 종료 파장

STEP WAVE : 측정 주기(간격)

Step wave가 클수록 결과는 완만한 곡선으로 나타남

아까 위에서 설명한 큐벳의 종류에 따라서, 혹은 사용자가 측정하기를 원하는 파장 영역에 따라서 파장 범위를 설정하면 된다.

6) 먼저 C버튼을 눌러 blank에 대한 Base Line을 구한다.

7) C의 Base line 과정이 모두 완료되었다면, D버튼을 눌러 시료에 대한 흡광도를 측정한다.

이 때 최대 흡광도 수치가 0.3 ~ 1.0 범위 안에 있어야 한다. 흡광도 수치가 되도록이면 높을수록 좋다. (시간에 따른 변화를 관찰하기 때문)

8) 시료용액을 적절하게 보관해두고 주어진 시간 간격으로 흡광도 측정을 반복한다.

★주의사항: 시료를 옮기는 과정에서 침전된 나노 입자가 다시 분산되지 않도록 흔들리지 않게 주의한다.

9) 측정이 완료된 후 .ODF file과 Excel file을 저장한다.

.ODF (raw file) 저장 : File→ Save 클릭하여 저장한다.

Excel file 저장 : File→ Excel로 저장 클릭하여 저장한다.

Result processing

1) 시간 간격으로 측정한 data들을 한 sheet로 정리한 후 그래프를 그린다. (excel, origin, sigmaplot 등) sigma plot을 이용하여 그래프를 그린경우를 보면,

UV-Vis equipment6.png

위의 그림은 1열: 파장 (step interval = 5) , 2열-7열: 0/3/6/12/24/48시간에서의 흡광도 결과임

2) 시간에 따른 흡광도의 변화 개형을 한눈에 보기위해 Sigma plot을 이용하여 plot한다.

분석하는 나노입자가 측정 파장 영역에서 최대 흡광 Peak을 보이나 측정하는 시간 동안 Peak의 위치가 변하는 경우 nm 파장에서의 흡광도 수치를 비교한다.

UV-Vis equipment7.png

3) 2)에서 최대 파장에서의 각 시간 별 흡광도 수치를 0시간 때의 흡광도 수치로 나눈 값을 시간에 따른 그래프로 그린다.

UV-Vis equipment8.png

A_normalized=A_sample/A_0h

Normalized optical density (OD)로 나타낸 그래프를 통해 용액 내 입자의 분산안정성에 대하여 예측할 수 있다.