Microscope

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형광의 원리

전자가 안정된 상태에 있는 경우를 기저상태(ground state)라고 하는데 외부로부터 에너지가 공급되면 전자가 이 에너지를 흡수하여 높은 에너지 준위로 올라가게 된다. 그러나 전자는 높은 에너지 준위에서 계속 머물러 있을 수 없기 때문에 진동에너지(vibrational energy), 열에너지(heat energy, quenching) 같이 광선이 아닌 에너지(nonradiative energy)로 변환되기도 하고, spin 방향의 변화를 일으키는 계간전이(intersystem crossing)에 의해서 triplet 형태로 바뀌어 인광을 발생시키기도 하며, singlet형태의 여기전자가 기저상태로 되면서 형광을 발생하게 된다.

여기시키기 위해서 사용되는 여기광(excitation light)과 동등한 에너지를 전자가 흡수하여 그에 해당된 높은 에너지 준위에 올라가지만 에너지의 일부가 진동에너지나 열에너지 등으로 분산되기 때문에 에너지의 일부를 손실하게 되어 실질적으로 발생되는 형광은 여기광보다는 낮은 에너지를 갖는 즉 파장이 길어진 형태의 전자파가 된다.

좋은 형광영상을 얻는 방법

좋은 형광영상이란 형광색소가 존재하지 않는 background는 어둡고 검게 그리고 형광색소가 발광하고 있는 부분은 형광이 밝아 signal to noise ration(S/N ratio)가 높은 영상을 말한다. 좋은 형광영상을 얻으려면 형광색소를 효율적으로 자극한 후 표본으로부터 나오는 형광을 효율적으로 집광하여야 한다. 따라서 형광색소의 여기(excitation)와 발광(emission)을 좌우하는 형광cube의 선택과 형광의 관찰에 적절한 대물렌즈에 대하여 설명하고자 한다.

형광cube의 선택

형광색소에 적절할 것

기본적으로 형광색소의 여기파장에 적합한 여기필터와 형광파장에 적합한 흡수필터가 set로 된 형광cube를 선택하여야 한다.(Fig. 1). 그러나 실제로는 여기파장과 형광파장은 때로는 몇 nm정도밖에 떨어져 있지 않을 경우도 많기 때문에 반드시 모든 조건을 충족시켜주지 않을 수도 있다. 따라서 관찰하려는 형광색소에 대응하는 형광cube를 자유로이 선택하는데에는 한계가 있다. 그러므로 여러 가지 형광색소에 대응하는 추천 형광cube의 일람표가 각각의 제조회사로부터 제공되므로 그 표를 참고하여 선택하여야 한다.

예를 들어 FITC를 관찰하기에 적합한 형광cube (U-MWIB2; Olympus)는 460~490nm의 파장을 투과하는 여기필터와 510nm이상의 파장을 투과하는 흡수필터가 set로 되어 있다. FITC의 여기최대파장은 490nm, 형광최대파장은 520nm이므로 이 형광 cube를 사용하면 FITC를 여기시킬 수 있으며 동시에 FITC로부터 나오는 형광을 고효율로 모을 수가 있다.

형광 Fig1.JPG

Fig.1 형광 cube의 선택의 효과

BODIPY FL phallacidin형광사진

A: 적절한 형광cube를 사용하면 background가 검게되며 높은 contrast의 형광사진을 얻을 수 있다. 또한 형광색소도 원래의 녹색을 나타낸다.

B: 부적절한 형광cube를 사용하면 background가 부자연스럽게 밝게되며 형광색소가 황색을 나타내게 된다.

관찰목적에 적절할 것

동일한 형광색소를 관찰할 때도 여기필터의 파장범위가 다르면 형광사진이 다르게 나온다. 일반적으로 밝은 형광사진을 얻고 싶다면 형광파장 범위가 넓은 여기필터를 사용하며, contrast를 중시한다면 파장범위가 좁은 여기필터를 사용하여야 한다.(Fig.2)

형광 Fig2.JPG

Fig.2 여기필터의 파장범위의 효과

A: 형광cube로 U-MSWB2 (Olympus)를 사용하였을 때의 FITC 형광사진. 여기필터의 파장영역이 420~480nm로 넓기 때문에 형광사진은 가장 밝으나, 동시에 background도 높아진다.

B: 형광cube로 U-MWIB2 (Olympus)를 사용하였을 때의 FITC 형광사진. 여기필터의 파장영역이 460~490nm로 중간 정도이므로 형광사진이 적당히 밝으며, background도 적당히 나오고 있다.

C: 형광cube로 U-MNIB2 (Olympus)를 사용하였을 때의 FITC 형광사진. 여기필터의 파장영역이 470~490nm로 좁기 때문에 형광사진은 가장 어두우며, 동시에 background도 낮아지게 된다. 여기에서 나오는 background는 주로 대물렌즈와 배지로부터 유래하는 자가형광에 의한 것이다.

다중염색표본을 관찰할 때

표본을 2종류 이상의 형광색소로 표식하였을 경우, 1종류씩 나누어 관찰할 수도 있고 또한 복수의 형광색소를 동시에 관찰할 수도 있다.(Fig.3)

형광 Fig3.JPG

Fig.3 다중염색표본의 형광사진

A549세포의 미소관을 FITC로 표식, 핵을 PI로 표식하였다.

A: FITC와 PI를 동시에 여기한 형광사진(형광 cube는 U-MWIB2를 사용)

B: FITC 만을 여기한 형광사진(형광 cube는 U-MWIBA2를 사용)

C: PI만을 여기한 형광사진(형광 cube는 U-MWIG2를 사용)

기기 구성

형광 현미경 사진2.JPG

측정 방법

  1. Power supply(전원 공급기)의 전원을 on으로 한 후 안정화시키기 위해서 15분동안 기다린다.
  2. 반사되어 나오는 형광 빛의 세기가 적절한 지 확인한다.
  3. 재물대에 샘플을 위치시킨다.
  4. 셔터를 열고, 빛이 램프하우스로부터 샘플로 잘 지나가는 지 확인한다.
  5. 형광단의 Ex/Em에 맞춰서 측정하기에 적합한 필터 큐브를 선택한다.
  6. 스탠드를 조절하는 스위치를 이용해서 빛이 샘플을 잘 통과하는 곳으로 스탠드를 이동시키고, 접안렌즈를 이용해서 눈으로 시료를 본다. 시료를 눈으로 보기 위해서는 선택 레버의 위치를 파악해야하는데, 이 길이가 짧은 경우(들어갔을 때) 우리는 눈으로 시료를 볼 수 있다.
  7. 눈으로 보는 과정에 있어서, 좀 더 명백하게 시료를 보고 싶다면, 미동나사를 이용해서 초점을 조절해주면 된다.
  8. CCTV 카메라로 보고 싶다면, MetaMorph 프로그램을 사용해서 보면 된다.

8-1 시료의 이미지 얻기

1) 스위치를 이용해서 카메라의 전원은 on으로 바꾼다.

2) MetaMorph 프로그램을 열고 나서 이 소프트웨어가 CCTV 카메라랑 연결이 될 때까지 기다린다.

3) 메뉴에 있는 Acquire를 눌러서 그림을 얻을 수 있다.

4) 현재의 이미지를 실시간으로 보고 싶다면 show live 버튼을 눌러서 진행하면 된다. 그리고 일차적으로 초점을 맞추기 위해서 Auto 노출 시간(exposure time)을 선택한다. 만약에 이미지가 너무 어둡다면, 노출시간을 조금 더 증가시키면 밝은 이미지를 얻을 수 있다.

5) Scale tool을 이용해서 초점이 맞춰졌는 지 아닌 지를 판단한다.

9. imageJ 프로그램을 이용해서 데이터 분석을 실시한다.

적용 분야

<용액 안에 있는 형광 입자 분석>

-현미경으로 분석하기 위한 샘플 준비 방법

1. 병에 있는 용액을 충분히 흔들어 준다.

2. 병에 들어 있는 용액을 2~4개 정도로 나누어준다.(한꺼번에 필터링 시키게 되면 뭉치는 경우가 생길 수도 있기 때문에)

3. 필터 페이퍼와 필터 장치를 이용해서 용액 안에 들어있는 형광 입자를 필터에 걸러준다.

4. 오븐에 대략 2~5분 정도 말려준다.

-현미경으로 샘플 분석하기

1. 분석하기 전에 샘플을 현미경으로 측정하는 곳에 올려 놓는다.

2. 형광 입자를 분석할 것이기 때문에 형광 소스와 카메라를 off->on 으로 해준다.

3. 잠시 예열을 마치고 난 후 Metamorph 프로그램을 클릭한다.

4. Acquire 과 Multi dimensional acquisition을 클릭한다.

5. Multi dimensional acquisition에서 stage로 간 후 load를 이용해서 매크로 파일을 불러온다.

6. Position을 1번과 맨 마지막에 있는 번호로 이동을 시켜보면서 샘플이 그 범위 안에 들어오는 지 파악한다.

7. 샘플이 보이는 영역(ex 가운데)에 position을 위치시킨 후에 focus를 맞춰서 샘플이 잘 보이는 지점을 찾는다.

8. 6번 과정을 진행하는데 있어서 필터 큐브를 바꿔주도록 한다. 이 때 형광 입자에 맞는 필터 큐브를 선정하면 된다.

9. 나머지 설정들을 파악한 후 오른쪽 아래에 있는 acquire을 눌러주게 되면 현미경이 자동으로 측정을 시작한다.

-측정한 데이터 정리

1. ImageJ프로그램을 클릭해준다.

2. Image -> stacks -> stack to images 과정을 이용해서 많은 그림들을 하나로 만들어 준다.

3. 하나의 그림 안에 있는 입자의 개수를 수동으로 얻는다.