DLS measurement

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서문 (Foreword)

Dynamic light scattering (DLS)

적용범위(Scopy)

배경 (Background)

유체학적 크기(Hydrodynamic size)

원리 (Theory)

나노입자의 응집현상에 따른 입자의 크기분포 변화는 DLS(Dynamic Light Scattering, 동적광산란법)를 이용하여 측정할 수 있다. DLS는 주로 입자분석에 이용하는 장비로 시료 내 입자에 의한 레이저 빛의 산란 강도 측정을 통하여 입자의 크기를 알 수 있다. DLS의 내부에는 digital correlator가 있어서 일정 시간 구간에 대한 두 신호 간의 유사도를 측정할 수 있다. DLS는 Brown 분자운동을 측정하여 용액 중 입자의 크기를 알아낸다. Brown 분자운동이란 액체 중에 부유하는 미립자가 열운동을 하고 있는 액체분자에 끊임없이 충돌하는 불규칙적인 운동으로, 유체의 온도, 입자의 크기, 점도에 매우 의존적이다. 유체의 점도와 온도를 이용하여 입자의 크기를 알아낸다. 입자의 크기에 따라서 브라운 운동을 하는 속도는 서로 다르므로, 산란광의 시간에 따른 correlation function를 수학적으로 분석하면 입자의 크기를 유추할 수 있다. 크기가 작은 입자의 경우에는 큰 입자보다 속도가 빠르므로 correlation function이 decay되는 속도 또한 훨씬 빨라진다. 따라서 correlation function을 측정함으로써 입자의 크기 분포를 계산할 수 있게 되는 것이다.

Figure 1. Correlation function

주의사항 (Precautions)[1]

  1. DLS 측정을 위한 시료는 2 nm~3 000 nm 사이의 크기가 적당하다.
  2. 시료의 농도가 너무 낮을 경우에는 측정에 충분한 산란이 일어나지 않을 수 있으며, 농도가 너무 높을 경우에는 입자 하나에 의해 산란된 빛 외에 부가적인 산란(multiple scattering)이 일어날 수 있다.
  3. Correlation graph는 lognormal 모양이어야 하며, baseline으로 떨어져야 한다. 만약에 baseline 위에서 유지 된다면 먼지에 의한 영향이 있을 수 있으므로 필터를 사용하도록 해야한다. 필터 후에도 여전히 baseline 위에 떠있다면, 시료 자체에 문제가 있는 것이다.
  4. Count rate는 일초당 감지되는 photon의 개수를 뜻한다. Count rate를 이용하여 시료의 quality를 모니터링 할 수 있다.
  5. Correlation function을 통해서 시료의 상태나 문제점을 해석해 볼 수 있다.
  6. 20 nm 이상의 unaggregated 나노입자 분산액이 monodisperse할 경우에는 재현성 및 신뢰성이 높은 측정이 가능하다. 이때 측정된 hydrodynamic size의 경우 대체로 TEM으로 측정한 size값보다 약간 크다.

한계점 (Limitation)

장비 (Equipment)

Figure 2. Dynamic Light Scattering:An introduction in 30 minutes. Optical configuration of a Dynamic Light Scattering Instrument, page 12.

절차 (Procedure)

시료 준비 (Sample preparation)

1. 입자 크기에 따른 적정 농도조건은 다음의 그림과 같다.

Table 1. Concentration depend on the particle size

1) DLS를 측정하기 위해 필요한 적정 샘플양은 3 mL이고, 최소량은 1 mL로 이 경우, 샘플 홀더 아래에 큐벳 뚜껑을 설치한 후 샘플을 로딩해야 빛이 샘플을 통과할 수 있을 정도의 높이가 된다.

2) 만일 시간에 따른 측정을 하고자 한다면, 큐벳의 뚜껑을 닫고 파라필름으로 잘 밀봉하여 용액의 증발을 최대한 막아야 한다. 큐벳 내부에 먼지와 같은 이물질이 절대로 없어야 하며, 공기방울이 생기지 않도록 해야한다. 일회용 큐벳인 경우에는 깨끗한 상태로 보관하여 사용하도록 하고 quartz 재질의 큐벳인 경우에는 사용 전에 DI water로 3번, EtOH로 3번씩 세척한 후 뒤집어서 말리고 질소가스를 가볍게 쏘아줘서 물기를 없애준다.[2]

3) 측정 전 용액 내 입자들이 잘 분산되도록 시료용액을 15초간 충분히 vortexing해준다.

★주의 : 모든 샘플용액은 용액안에 기포가 생기지 않도록 주의해야 한다. 특히 In vitro 배지 시료용액의 경우, 용액자체가 기포가생기기 쉽기 때문에 더욱더 주의해야 한다.

2. 시료 상태에 따른 샘플링[3]

입자의 뭉침이나 이온 용출 등으로 인한 사이즈 에러가 없게 하기 위해서 반드시 DLS 측정 직전에 새로운 나노입자 stock solution을 준비해야 한다.

1) 용액시료일 경우

일반적으로 용액으로 존재하는 시료의 경우 적절한 농도로 묽혀 준다.

2) 고체 파우더시료일 경우

고체 파우더로 존재하는 시료의 경우 문헌조사나 존재하는 프로토콜에 따라 적정 용매에 묽혀 sonicator나 voltexing을 통해 잘 분산시켜 DLS를 측정한다. 용매에 묽히기 전에 water bath sonicator로 초음파 처리하여 stock solution을 15분간 분산시킨다.

예시) TiO2 파우더의 경우,

1 L의 DI water에 10 g의 TiO2 파우더를 넣어준 후 porbe sonicator을 이용하여 10분동안 분산시킨 후 만들어진 안정적인 분산용액을 측정하였다. (Song H.L et al. Bull.Korean Chem. Soc. 2014, Vol. 35, No.7)

★좀더 신뢰성 있는 결과를 위해서는 샘플을 여러 개 만들어서 측정한다.

예를 들어 TiO2 파우더를 DI에 분산시켜 DLS를 측정 시 결과값이 이상한 경우, 입자가 측정 도중에 침전되거나 애초에 고르게 잘 분산되어 있지 않은 상태에서 측정 했기 때문이다.

이와 같은 결과로 해석할 때 좀더 신뢰성 있는 데이터 해석을 위해 각각 세 번의 용액을 제조하여 분산시킨 후 측정을 한다면 결과해석에 대해 신뢰성을 더할 수 있다.

측정 (Measurement)

측정하기에 앞서 사용하는 장비의 모습은 이러하다. (Zetasizer Nano Series)

Figure 3. www.malvern.com, Zetasizer Nano ZS90.

1) 기기의 온도와 레이저의 안정화를 위해 장비를 켜고 30분 동안 예열시켜준 후 바탕화면에서 Zetasizer software를 실행시킨다.

2) DLS의 시료도입부의 커버를 열고 큐벳을 삽입한 후 커버를 닫는다.

3) Zetasizer Software프로그램을 실행한다.

Figure 4.

4) New 아이콘을 클릭하고, 위의 메뉴에서 File→New→Measurement File 을 클릭하여 측정 및 저장할 파일을 만든다.

Figure 5

5) Measure→Manual을 선택하여 Measurement type을 size로 설정한다. 이 후, 나노입자의 시료 정보를 입력한다. 특히 Equilibrium time의 경우 온도 안정화 시간이므로 최소 120초 정도로 설정한다.

RI, Abs 값은 Intensity data에 영향을 주지는 않지만, Volume distribution을 보려면 정확한 값이 필요하다.

Figure 6

-Measurement type : Size

-Sample – Material : 샘플 이름 및 Refractive index 지정

– Dispersant : 샘플의 용매 지정

– Temperature 및 equilibrium time : 측정 온도 및 입자 크기 측정하기 전 일정 시간 후에 측정이 시작되는 데 이 값이 클수록 측정이 오랜 시간 걸린다.

– Cell : 셀의 type 설정 (DTS0012)

5) Measurement 선택 후 Measure time에 반복측정 횟수를 입력하고 Data processing을 지정한다.

시료에 대한 기본 정보 입력이 끝난 후, START 버튼을 클릭하여 나노입자의 유체역학적 크기의 측정이 시작된다.

데이터 분석 (Data analysis)

1) 측정이 끝나면 제일 먼저 Quality Report를 확인하면 제일 먼저 간편하게 측정에 대한 정보를 얻을 수 있다. (Good or Poor 로 표시됨)

Figure 7. Example of monodisperse
Figure 8. Example of polydisperse

샘플의 조건에서 poor가 뜬 이유에 대한 원인을 보고 다시 측정한다.

★주의 Good 또는 Poor이 정확한 결과는 아니기 때문에 각각의 측정값에 대해 확인하는 절차가 필요함.

2) 측정한 시료에 대한 data를 클릭→메뉴 Edit→Copy size values

Figure 9


3) Excel 창에서 결과 값들을 붙여 넣고, x축과 y축을 바꿔서 재배열한다.

x축: 시간 y축: hydrodynamic size → x축: hydrodynamic size, y축: 시간

Figure 10

4) Sigmaplot을 이용하여 아래와 같은 contour plot을 그린다.

Figure 11

보고서 작성 (Report)

시험보고서에는 다음과 같은 사항들이 기재되어야 한다.

a) 측정날짜

b) 측정자

c) 시료 정보 : 시료명, 제품번호 등

d) 시료의 분산 용매

e) 시료의 전처리 방법

h) 측정된 입자의 유체역학적크기 및 크기분포의 평균값 및 표준편차

i) 측정 및 분석시 시험에 영향을 준 비정상적 특징

사례 연구(Case study)

유체역학적 크기분포측정

유체역학적 크기측정에 대한 실사례로 bPEI Ag 60 nm를 DLS를 이용하여 측정하였다.

대상 물질 : bPEI capped Ag NP, 60 nm

분산 용매 : DI

Figure 12-1

분석결과 : bPEI 리간드로 둘러싸인 은나노입자의 경우 64 nm (Z-average)의 크기로 DI 에 분산되어 있다는 결과를 얻을 수 있었다.

왼쪽은 DLS 측정결과에 대한 그래프로 단일 피크로 용액 내 넓지만 상대적으로 균일 하게 분포되어 있음을 확인할 수 있다. (PDI : 0.253)

유체 내 응집현상 측정

유체 내 응집현상을 측정하기 위해서는 DLS를 이용하여 시간별 유체역학적 크기분포를 측정하여야한다.

시간별로 유체역학적 크기분포를 측정하게 되면, 그 크기의 변화에 따라 입자가 용액안에서 잘 분산되어있는지 또는 응집되어있는지를 확인함으로써 용액 내 입자의 분산안정성을 측정할 수 있다.

아래는 SiO2입자를 DI water에 분산시킨 후 시간별로 유체역학적 크기분포를 측정한 결과를 예로 들었다.

Figure 12-2 DI water에 분산시킨 SiO2 나노입자의 시간별 유체역학적 크기분포[ (a) 0 h, (b) 3 h, (c) 6 h, (d) 9 h, (e) 24 h, (f) 48 h ]

0시간, 3시간, 6시간, 9시간, 24시간, 48시간일때 측정된 SiO2 나노입자의 유체역학적 크기분포(Z-Average 값)을 보면 6개의 유체역학적 크기분포값은 큰 변화가 없었다. 만약 용액안에서 응집이 잘되는 입자라면, 시간이 지남에따라 입자끼리 잘 응집하기 때문에 그에따른 유체역학적 크기분포가 증가할 것이다. 하지만, 예로 든 DI water에 분산시킨 SiO2 나노입자의 결과를 보면, 시간이 지남에따라 유체역학적 크기분포의 차이가 없었기 때문에 이 입자는 DI water 안에서 분산안정성이 높다고 말할 수 있다.

Figure 13. Contour polt of SiO2 Nanoparticles

최종적으로 sigmaplot을 이용해서 figure 13와 같은 contour plot을 그린다.

참고문헌 (References)

  1. Brookhaven 90 plus Nanoparticle size analyzer protocol / Graheme Wiliams / Boston University Biomedical Engineering Department Biointerface Technologies Core
  2. Basic protocol for Dynamic Light Scattering / Annette Erbse
  3. High Throughput Dynamic Light Scattering Analysis of Nanoparticle Dispersion in Cell Culture Media ver 1.1 / Zhaoxia Ji / UC CEIN(University of California, Center for environmental Implications of nanotechnology)